提高PCR扩增特异性,BlazeTaq™ SYBR® PCR试剂盒了解一下

发布者:亚游集团官网科技发布时间:2020-05-11

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      疫情当下,最热频的词汇莫过于核酸检测了。而核酸检测最核心的技术也越来越被大众所熟知,就是我们高中就学过的聚合酶链式反应,又称为PCR。

 

      自从1983年,Kary Mullis才发明出这个用于扩增目标DNA的研究工具—PCR技术后,其逐渐成为分子生物学研究必不可少的一部分,被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。而Kary Mullis也因这一发明获得了1993年的诺贝尔化学奖。

 

      而熟悉PCR的同学们都知道,PCR之所以能够在短时间内将单个DNA分子扩增数百万倍以便于下游实验检测,主要依靠这三个步骤连续多次循环而实现:

    (1) DNA变性:首先对双链DNA模板进行高温加热,使DNA双链变性解离成单链;

    (2) 引物退火:被称为引物的短DNA分子与目标DNA的侧翼区域结合;

    (3) 延伸扩增:DNA聚合酶沿着模板链将引物3’端进行延伸。将这些步骤重复(“循环”)25-35次,即可按指数方式获得精确的目标DNA拷贝。

 

DNA聚合酶延伸扩增

 

      而PCR这项核心技术的核心是强大的DNA聚合酶,其在新DNA链合成中扮演着重要的角色,是PCR反应不可或缺的组成部分,是保证PCR扩增产物特异性、热稳定性、保真度等方便的重要因素。

 

      而对目的基因进行PCR扩增的过程中,延伸错配的非特异产物和引物二聚体的产生是PCR实验中常遇到的问题,这些都与DNA聚合酶有关。因为这种非特异扩增会显著降低目的基因扩增的产率和灵敏度,从而影响扩增结果的合理解释和下游实验应用的成功。

 

       那么,问题来了,如何减少非特异性扩增?

 

      方案之一:在冰上配制PCR反应,这是我们经常的操作。因为这样有助于将DNA聚合酶的活性保持在低水平。

 

      但在PCR开始之前,依然可能会合成不需要的产物。

 

       另一个办法是将DNA聚合酶的加入时间推迟到第一个循环的退火步骤。因为只有在90℃以上的初始变性步骤之后才能开始扩增,所以该技术被称为“热启动”。所以后来为了避免非特异性扩增,科学家们开始进行手动热启动PCR反应,但是这个过程不仅费时费力,而且会增加样品污染和降低实验可重复性的风险。

 

      后来,人们发明了具有热启动特性的DNA聚合酶,既抗体修饰的DNA聚合酶。

 

      这种DNA聚合酶通过对酶活性位点抗体修饰,抑制其在室温下的活性,在初始高温变性步骤(如,>90℃)阶段,结合的抗体失活,从而激活DNA聚合酶。

 

激活DNA聚合酶

 

      由于DNA聚合酶在室温下的活性被抑制,所以,热启动技术为在室温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利,且不会影响特异性和扩增能力

 

      BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0系列PCR试剂盒既是基于抗体修饰法的qPCR定量检测试剂盒。

 

      BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0系列试剂盒采用了新型抗体修饰的BlazeTaq™热启动DNA聚合酶,室温时酶的活性被抗体完全封闭,更有效地抑制非特异性扩增;反应时只需95°C预变性30 s即可使酶完全被激活,可明显地缩短qPCR反应时间。此外,优化的Buffer体系显著提高Real Time PCR反应的灵敏度和重复性,同时具有扩增效率高、特异性强、检测范围广的特点,并能有效抑制引物二聚体的产生,使实验结果更加可靠。

 

      本产品提供了一种通用的反应条件及实验操作流程,且推出带有、或不带有ROX参比染料的两个版本供用户选择,适用于大多数荧光定量 PCR 仪。

 

       产品优势

 

      灵敏度高:可检测低至5个拷贝数的DNA模板

      特异性强:抗体修饰热启动DNA聚合酶,更有效抑制引物二聚体以及非特异性扩增的产生

      扩增效率高:在宽广的GC含量范围内能维持高扩增效率

      操作简单:预先配好的5×预混液,反应前只需加入模板、引物、灭菌水

      适用性广:提供带有或不带有ROX的两个版本可选,适用于大多数荧光定量PCR仪

 

BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0系列试剂盒

 

BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0系列试剂盒扩增曲

      图1. 使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0扩增8个10倍梯度稀释的双链DNA片段,DNA拷贝数范围为5×107~5个拷贝。如图所示,试剂盒显示出高灵敏度的特性,在宽广的定量范围内具有优异的线性相关性。

 

        竞品产品性能对比:

 

竞争产品性能对比

 

      图2.使用Hela细胞系的梯度稀释的cDNA扩增B2M基因。BlazeTaq™(红色)与BioRad SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix(蓝色)的性能对比显示在相似扩增性能下,前者具有更强的信号。

 

BlazeTaq™,Powerup™ SYBR Green Master

 

       图3. BlazeTaq™(红色)与Powerup™ SYBR Green Master Mix(绿色)和Promega(蓝色)GoTaq® QPCR Master Mix(绿色)的性能对比显示,其灵敏度、扩增效率和特异性更高。

 

BlazeTaq™,PowerUp™ SYBR Green Master

 

      图4. Ct值比较。 使用BlazeTaq™(蓝色),Applied Biosystems的PowerUp™ SYBR Green Master Mix(橙色)和来自Promega的GoTaq® qPCR Master Mix(灰色)扩增来自10 ng HeLa cDNA的41个基因。

 

BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0扩增

 

      图5.使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0分别扩增50个和5个拷贝数的同一个DNA模板,并设无模板对照(NTC组),每组qPCR反应重复24次。结果显示,试剂盒对低浓度模板的扩增实验重复性好。cDNA的41个基因。

 

BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0扩增

 

      图6. 使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0分别扩增不同GC含量(GC含量范围在39.3~61.2%之间)的DNA模板。结果显示,各模板的扩增效率仍能维持在90%~110%之间,表明试剂盒对GC含量在一定范围内的DNA模板适用性广。

 

       详细的产品列表,欢迎选购!

 

产品名称 描述 货号 规格
BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix2.0 新型real-time PCR专用试剂,包含已优化浓度的抗体修饰Hot-start DNA聚合酶、Buffer、dNTP、Mg2+和SYBR Green的混合试剂,以及ROX参比染料 QP031 20ul体系×200次qPCR反应
QP032 20ul体系×600次qPCR反应
QP033 20ul体系×1200次qPCR反应
BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix2.0 (without ROX) 新型real-time PCR专用试剂,包含已优化浓度的抗体修饰Hot-start DNA聚合酶、Buffer、dNTP、Mg2+和SYBR Green的混合试剂 QP041 20ul体系×200次qPCR反应
QP042 20ul体系×600次qPCR反应
QP043 20ul体系×1200次qPCR反应

 

 

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                       三点:

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